文献解读|弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的单细胞转录组图谱-技术前沿-资讯-生物在线

文献解读|弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的单细胞转录组图谱

作者:上海伯豪生物技术有限公司 2023-09-26T00:00 (访问量:11802)

期刊:Cell Reports

影响因子:8.8

 

导语

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见但侵袭性最强的B细胞淋巴瘤之一,大约40%的患者仍然无法治愈。本研究使用单细胞测序(scRNA-seq)技术成功绘制了弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的单细胞转录组图谱,揭示了DLBCL病例内部、病例之间的表型异质性。还首次揭示了DLBCL肿瘤细胞与微环境细胞的互作网络,并进一步验证了HBV感染对肿瘤细胞生存及免疫逃逸方面的影响,深入地解析了DLBCL的生物学特点,也为DLBCL免疫治疗方面提供了新的启示。

 

研究技术

scRNA-seq

 

研究路线

对17例DLBCL(HBV+×7,EBV+×2,HBV-EBV-×8),1例滤泡性淋巴瘤FL(HBV-EBV-),Burkitt’s淋巴瘤BL(HBV+),1例淋巴组织增生RLH(HBV+)共20个样本进行scRNA-seq,对DLBCL恶性细胞和良性细胞绘制综合细胞图谱,再对肿瘤微环境中恶性B细胞、T细胞、骨髓细胞进行深入分析。

 

研究结果

1.DLBCL单细胞图谱揭示恶性B细胞的肿瘤间异质性

对来源于17个DLBCL 和3个对照样本的 94,324个细胞进行单细胞RNA测序(图1A),利用标记基因区分出B细胞(54%)、T细胞(41%)、髓系细胞(2.8%)、NK细胞(0.8%)、成纤维细胞(0.4%)、内皮细胞(0.4%),并采用拷贝数变异(copy number variation, CNV)成功将恶性B细胞(46.5%)与正常B细胞(7.5%)区分开来(图1B、1C)。随后在每种主要细胞类型(>所有细胞的1%)内进行重新聚集,总共鉴定出23个恶性细胞亚群和29个非恶性细胞亚群(图1D)。在恶性B和T细胞亚群中发现了更多的细胞,并且每个细胞表达的基因数量与恶性B细胞亚群相关(图1E)。此外,恶性B细胞具有高度的患者特异性,而不同个体的非恶性细胞具有相似的基因表达谱(图1F)。针对来源于每一个患者的恶性B细胞进一步分析,每个DLBCL样本的恶性细胞中发现了一组独特的高表达基因,采用非负矩阵分解(NMF),共鉴定出73不同的基因表达特征,最终定义了8个常见表达特征,这也提示了DLBCL在不同患者之间以及肿瘤内部存在高度异质性(图1G)。

图1 B细胞淋巴瘤单细胞图谱

2. HBV+患者肿瘤细胞中MHC-II表达特征基因的高表达

为估计在恶性B细胞中发现的任何共享表特征是否与HBV感染相关,对 HBV+和 HBV- EBV-组的样本之间的表达评分进行了比较,只有 MHC II 表达特征的表达评分在 HBV+ 组中显着较高(图2A)。此外,属于MHC II表达特征的9个基因在每一个HBV+患者的恶性细胞中显着高于HBV-EBV-组。随后对HBV+和HBV- EBV-恶性细胞之间的基因表达谱进行了直接比较,MHC II表达特征的基因确实是HBV+恶性B细胞中差异表达的基因之一(图2B)。紧接着比较了DL05和DL13两个样本诊断和复发的恶性细胞,在复发样本DL13中,从恶性细胞中提取了7个基因表达特征,其中6个特征与DL05中鉴定的特征重叠(图2C)。值得注意的是,MAPK特征只在DL13中表达。随后对DL05和DL13的恶性B细胞进拟时序分析,总共确定了2个分支点和5个状态(图2I),通过关注疾病复发的机制,在轨迹的分支点 2 处进行分支分析,鉴定出一组在状态5下高表达的基因,包括几个MAPK信号相关基因,这可能与DLBCL患者的复发有关(图2K)。

图2 DLBCL的肿瘤内和肿瘤外异质性

3. 非恶性B细胞亚群细分

针对非恶性B细胞进行重新聚类,细分得到5个Naive B亚群和3个Memory B细胞亚群(图3A-3C)。随后鉴定了每个亚簇中差异和高表达的基因,并将其聚类为7个基因集(图3D-3E)。HBV+ 组中富集的Bmemory-1似乎与HBx刺激有关,并可能与病毒复制有(图3G)。同样有趣的是,在 HBV+ 样本中发现了表达EGR2和表达EGR3的恶性B细胞,这表明来自HBV+患者的DLBCL样本中的恶性细胞亚群也可能与HBx刺激相关(图3H)。EBV+ DLBCL样本中的B细胞 Bmemory-3 亚群可能与EBV感染有关。对浸润性非恶性B细胞进行轨迹分析,确定了2个主要轨迹,并在轨迹的分支点1处进一步进行分支分析,鉴定出富含多种途径的基因,推测它们可能决定HBV相关的细胞命运(图3I-3L)。

图3 B细胞淋巴瘤中的非恶性B细胞

4. T细胞亚群细分

对T细胞进行重新聚类,得到CD4+T细胞、CD8+T细胞共16个亚群,根据之前的研究最终划分为5个分类,分别为初始T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞 (Treg)、T (Tfh) 、 T 17 (Th17)(图4A-4C)。对于细胞毒性 CD8+ T细胞,细胞毒性标记物的表达水平与共抑制受体的表达水平高度相关,表明这些 T 细胞中可能存在激活依赖性耗竭表达程序(图4D)。通过比较平均细胞毒性和耗竭分数,发现两个细胞毒性亚簇 CD8cyto-4 和 CD8cyto-6 比其他细胞毒性亚簇具有更强的耗竭状态(图4E)。所有T细胞亚簇均由来自三个或更多样本的细胞组成(图4F)。随后鉴定了每个亚群的差异和高表达基因,并将其聚类为 14 个基因集(图4G)。在 HBV+ 和HBV-EBV- 组之间未观察到每个样本的T细胞亚群百分比存在显着差异(图4H)。对CD8+T细胞和CD4+T细胞分别进行轨迹分析,都确定了2条主要轨迹,其中CD8+T细胞两条主要轨迹细胞毒性和耗竭分数都很高(图4I-4J)。

图4 B细胞淋巴瘤中的T细胞

5. 骨髓细胞亚群细分

针对髓细胞进行重新聚类,得到3个巨噬细胞亚群(MP)、2个传统DC亚群(cDC)、一个浆细胞样DC(pDC)亚群共6个脊髓细胞亚群(图5A-5C)。其中cDC-c1亚群高表达CLEC9A,pDC亚群高表达CLEC4C,cDC-c2亚群高表达LAMP3的同时还高表达CD274,表明 DC 亚群对T细胞具有潜在的抑制作用(图5E-5J)。HBV+和HBV-EBV-组之间DC亚群的比例没有观察到显着差异,有趣的是,cDC-c2亚群主要与DLBCL的ABC亚型相关(图5C)。结合巨噬细胞的体外功能表型M1和M2分析,结果显示MP-c1与促炎M1特征密切相关,MP-c2与抗炎M2特征和吞噬作用特征相关,MP-c3与M2和血管生成特征的高表达相关(图5F)。另外,对HBV+患者的DLBCL样本中观察到MP-c2 的百分比显着较高(图5G),还对 MP-c2 中的巨噬细胞与其他亚群中的巨噬细胞之间的基因表达进行了比较,确定了MP-c2 中优先表达的 11 个基因(图5H)。

图5 B细胞淋巴瘤中的髓系细胞

6. 肿瘤微环境中亚群间的调控关系

为了解细胞亚群之间的调控关系,研究免疫相关的配体-受体对相互作用,结果显示骨髓细胞亚群拥有最多数量的配体,而细胞毒性 CD8+ T 细胞亚群拥有最多数量的受体(图6A,最能预测抗原呈递细胞和T细胞之间的调节轴(图6B)。重点关注与恶性细胞的相互作用,例如,CD40LG-CD40可能促进HBV+ 组DLBCL中恶性细胞与初始CD4+T细胞之间更强的相互作用(图6C-6E)。此外,CD4+ Tfh和恶性细胞之间通过BAFF介导的信号传导存在暗示性相互作用,并且这些相互作用仅在 HBV+ 患者中观察到(图6D)。DLBCL的另一个值得注意的发现是预测恶性细胞和 CD8+毒性细胞以及Tregs之间的CD70-CD27 相互作用,这可能进一步导致T细胞耗竭和抑制(图6F-图G)。

图6 基于配体-受体互作的细胞通讯

 

参考文献:

Ye X, Wang L, Nie M, Wang Y, Dong S, Ren W, Li G, Li ZM, Wu K, Pan-Hammarström Q. A single-cell atlas of diffuse large B cell lymphoma. Cell Rep. 2022 Apr 19;39(3):110713. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110713. PMID: 35443163.

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