导语
世卫组织于2021年发布了最新的空气质量指南，其中建议的PM2.5年度安全限值从10 μg/m3降低到5 μg/m3。PM2.5由于体积小，表面积大，可以携带多种有毒物质和可以通过鼻腔和呼吸道进入肺部，最终通过肺泡内的空气交换对其他器官造成损害。最近的研究报道，PM2.5既可以通过胎盘直接作用于胎儿，也可以间接诱导胎盘的表观遗传修饰来影响胎儿的发育。特别是，产前PM2.5暴露与后代发生神经发育障碍的风险增加有关。例如，产前接触PM2.5会导致后代的记忆和认知障碍，并增加了儿童患自闭症谱系障碍和注意力缺陷/多动障碍的风险。
研究重点
产前PM2.5暴露诱导男性后代髓磷脂发育异常。
产前PM2.5暴露改变了男性后代的髓鞘形成相关基因。
产前PM2.5暴露损害了男性后代的髓鞘超微结构。
PM2.5通过lncrna-Ctcf信号通路干扰髓鞘的发育。
研究技术
全转录组测序
（技术服务由伯豪生物提供）
技术路线
研究内容
1.男性后代大脑皮层中WGCNA的mRNA转录谱和聚类划分的时间序列分析
对男性后代的大脑皮层进行转录组测序，发现差异基因2052 个，对其进行WGCNA分析，得到5个模块，棕色模块（r = 0.92，p = 1e-10）与时间点呈显著的正相关，表明在产前PM2.5暴露后，它受男性后代大脑发育窗口的影响最为显著。
2.模块中mRNA表达谱的富集分析
棕色模块中有403个差异基因的富集分析显示主要与髓鞘形成和神经元的保护相关。髓鞘是由成熟的少突胶质细胞产生的，通过轴突的螺旋包裹和压实，由内而外地形成多层膜结构。富集分析也在底物粘附依赖的细胞扩散中富集。提示产前暴露PM2.5可能会以时间序列模式中断髓鞘结构的发育。
3. 产前PM2.5暴露后男性后代髓鞘发育异常
首先通过RT-qPCR进行验证Fa2h、Mal、S100b、Tppp、Trf、Abca2、Cntnap1、Eif2b5、Tnfrsf21、Tnfrsfsf1b和Sh3tc2。其中，Fa2h、Mal、S100b和Tppp对髓鞘的正常发育至关重要，在髓鞘的建立和维持中起着重要作用。同时发现基因随着时间变化有着不同变化，如Fa2h、Mal、S100b和Tppp的表达在发育后期显著降低（PNDs 14和21）；Trf水平从PND 1到PND 21持续下降等。11个基因使用比较毒物基因组学数据库（CTD），它们都参与了脱髓鞘疾病，且大多数基因的推断得分（除Trf和Cntnap1外）的推断得分也具有较高的相关性。髓鞘的形态学相对应也发现异常。
4. 产前PM2.5暴露后，男性后代中lncRNA表达谱紊乱
为了鉴定可能参与髓鞘异常发育的lncRNA，我们进行了lncRNA测序（lncRNA-seq），获得了PND 21上男性后代皮质的lncRNA表达谱。选择了45个lncRNA与mRNA相关性分析。有37个lncRNA与10个髓鞘化相关基因共表达，然后集中在前两个lncRNA（NONMMUT058932.2，NONMMUT029203.2）可能与6个mRNA（Fa2h、Mal、Sh3tc2、Trf、Tppp、Eif2b5）相互作用。此外，lncRNA NONMMUT062500.2可能调控Abca2和S100b的表达，而lncRNANONMMUT034761.2和NONMMUT003638.2分别只可能与Cntnap1和Tnfrsf1b相互作用。RT-qPCR对NONMMUT058932.2和NONMMUT029203.2的表达进行了验证，结果与lncRNA-seq数据一致。
5. lncrna在男性后代髓鞘形成异常中的转录调节
由于lncRNAs通过结合转录因子在基因调控中发挥关键作用，我们进一步研究了两个lncrna之间可能的转录调控。利用基于公开的小鼠神经元ChIP-seq数据集的ChIP-Atlas预测上述6个基因的潜在TFs，包括Fa2h、Mal、Sh3tc2、Trf、Tppp和Eif2b5。根据被覆盖基因的数量对TFs进行排序，以CCCTC结合因子（Ctcf）为最优转录因子。为了验证lncRNONMMUT029203.2和NONMMUT058932.2与Ctcf的结合能力，我们在PND 21上对男性后代的大脑皮层进行了RIP实验。结果表明，Ctcf是NONMMUT029203.2和NONMMUT058932.2的相互作用蛋白，产前PM2.5暴露显著降低了相互作用。
结论
产前PM2.5暴露后男性后代大脑皮质的转录组结果。使用two-way ANOVA和WGCNA发现，对神经发育过程影响最显著的是髓鞘的发育。lncRNA NONMMUT058932.2和NONMMUT029203.2通过减少与Ctcf的结合，调控髓鞘化相关基因（Fa2h、Mal、Sh3tc2、Trf和Tppp）的表达，在这一过程中发挥关键作用。我们的研究首次为产前PM2.5暴露后男性后代髓磷脂发育异常提供了转录水平的基因组证据。
参考文献：
Hou Y, Yan W, Li G, Sang N. Transcriptome sequencing analysis reveals a potential role of lncRNA NONMMUT058932.2 and NONMMUT029203.2 in abnormal myelin development of male offspring following prenatal PM2.5 exposure. Sci Total Environ. 2023 Jun 20;895:165004.doi:10.1016/j.scitotenv.2023.165004. Epub ahead of print. PMID: 37348736.