2022《保健食品功能评价斑马鱼试验规程》标准解读
标准背景
2022年4月15日，由中国保健协会管理归口，杭州环特生物科技股份有限公司牵头，中国标准化研究院、农业农村部食物与营养发展研究所、中国疾病预防控制中心营养与健康所、中国中医科学院中药研究所、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所等22家企业、科研院所共同起草的团体标准——《保健食品功能评价 斑马鱼试验规程》（T/CHC2003-2022）正式发布并实施。
为了使大家更好地了解《保健食品功能评价斑马鱼试验规程》这一团体标准重点内容，帮助更多的保健食品企业在研发中更好地应用斑马鱼技术开展斑马鱼实验，从而适应保健食品行业消费者需求变化快、产品研发周期短的发展趋势，环特生物推出“团体标准解读”系列，供大家参考。第一期《标准解读（一） | 《保健食品功能评价斑马鱼试验规程》团体标准解读！》（点击可回顾）已推出。
今天，我们将为大家送上第二期，快一起来看吧↓↓
主要内容及解读
正式试验内容及解读
1. 试验分组
标准原文：
正式试验按照以下方法挑选斑马鱼置于微孔板中进行分组：
a) 正常对照组：含斑马鱼及标准稀释水；
b) 模型对照组：含有模型诱导剂和斑马鱼；
c) 阳性对照组：含有阳性对照样品、模型诱导剂和斑马鱼。每次试验设置一个阳性对照组即可；
d) 受试样品测试组：含有受试样品、模型诱导剂和斑马鱼。将受试样品储备液用标准稀释水以几何级数稀释成一组适宜的浓度系列，备用。宜设置3～5个浓度组，以几何级数浓度系列设置受试样品浓度梯度，浓度的间隔系数≤3.2，宜设为2；
e) 溶剂对照组：含有助溶剂、模型诱导剂和斑马鱼。当受试样品配制过程中使用了助溶剂，应设置该组，助溶剂浓度应该保持一致，且浓度不大于1%（W/V或V/V）。
标准解读：
正式试验设置正常对照组、模型对照组、阳性对照组、受试样品测试组（宜设置3～5个浓度组，以几何级数浓度系列设置受试样品浓度梯度，浓度的间隔系数≤3.2，宜设为2）、溶剂对照组（当受试样品配制过程中使用了助溶剂，应设置该组，助溶剂浓度应该保持一致，且浓度不大于1%（W/V或V/V））。
对于助溶剂的使用限量，根据长期积累的数据以及本标准涉及到实验内容的特点，本标准将助溶剂的浓度上限定为1%（W/V或V/V）。1%的浓度上限并不意味着所有助溶剂的终浓度都可以用到1%。在实验溶液配制不受影响的情况下，助溶剂的使用量通常不应超过0.1%。只有当受试样品溶解性确实不好且助溶剂安全性非常好的的情况下，方可将助溶剂的终浓度增加到1%。
2. 造模
标准原文：
选择受精后一定天数的斑马鱼，用诱导剂处理一段时间，建立斑马鱼保健食品功能评价模型。根据保健食品功能选择合适的斑马鱼模型。
标准解读：
不同保健食品功能选择的斑马鱼模型不同，造模方式也不一样。选择受精后一定天数的一定品系的斑马鱼，用诱导剂处理一定的时间，建立斑马鱼保健食品功能评价模型。根据保健食品功能选择合适的斑马鱼模型，不同斑马鱼模型的建立方法。
3. 受试样品处理
标准原文：
根据试验需求，预先筛选好足够数量且发育正常的斑马鱼胚胎，并随机分配到试验容器中，每孔斑马鱼数量至少为10尾。用模型诱导剂建立斑马鱼模型，然后向试验容器中加入一定体积的受试样品溶液（饲养密度宜为1尾/100μL）、阳性对照样品。充分混匀后，用铝箔纸包裹，在28℃生化培养箱中避光孵育至终点。
4. 死亡与毒性判断
标准原文：
当所有试验组斑马鱼死亡率≤10%时，准许进入数据采集阶段。
5. 数据采集
标准原文：
应根据不同斑马鱼保健食品功能评价模型的具体评价指标选择合适的数据采集方式，数据采集具体方式如下：
a) 直接拍照：孵育结束后，从表型正常的斑马鱼中随机选取至少10尾斑马鱼，用三卡因麻醉后，将斑马鱼用3%甲基纤维素固定（甲基纤维素应提前在室温放置至少30分钟），在体视显微镜或荧光显微镜（转基因荧光斑马鱼品系相关的试验）下观察、拍照并保存。所有试验组斑马鱼拍照应在相同的仪器和环境条件下完成，且斑马鱼体位保持一致。利用图像处理软件测量累积光密度（体视显微镜）或荧光强度（荧光显微镜），每组的有效数据量不低于10个。
b) 染色后拍照：孵育结束后，试验容器中的斑马鱼用养殖水清洗3次，采用特异性荧光染料或组织化学染料对各组斑马鱼进行染色。染色后各组至少取10 尾斑马鱼，用3%甲基纤维素固定。特异性荧光染料染色的斑马鱼用荧光显微镜观察、拍照并保存，组织化学染料染色的斑马鱼用体视显微镜观察、拍照并保存。利用图像处理软件对图像进行分析，测量累积光密度（体视显微镜）或荧光强度（荧光显微镜），每组的有效数据量不低于10个。
c) 运动行为分析：孵育结束后，试验容器中的斑马鱼用养殖水清洗3次，每个试验组随机选择斑马鱼转移至96孔板中，每孔1尾，利用行为分析仪记录斑马鱼的运动轨迹，记录时间宜为20 min～1 h，每组的有效数据量不低于10个。
d)酶标仪检测：孵育结束后，试验容器中的斑马鱼用养殖水清洗3次，每个试验组随机选择斑马鱼转移至96孔板中，每孔1～3尾，按照试剂盒检测说明书进行试验操作，利用酶标仪测定OD值、荧光值或生物光值。选择符合检测试剂要求的激发波长和发射波长，检测时间宜为20 min～1 h，每组的有效数据量不低于3个。
标准解读：
应根据不同斑马鱼功能评价模型的具体评价指标选择合适的数据采集方式，数据采集具体方式如下：
a）直接拍照：斑马鱼的胆囊在斑马鱼躯干偏右侧，当斑马鱼侧躺时，如果背朝上、头向右的话，胆囊可能会对拍照造成干扰。为了保证所有斑马鱼的体位尽量固定并保持一致，建议用低熔点琼脂糖或甲基纤维素等对斑马鱼进行固定。斑马鱼从开始麻醉到拍照结束的时间不宜超过30分钟，超过30分钟可能会对斑马鱼造成损伤或导致死亡。利用图像处理软件对图像进行分析，测量累积光密度（体视显微镜）或荧光强度（荧光显微镜），为了保证后续统计分析结果的有效性，每组的有效数据量不低于10个。
b）染色后拍照：拍照时一般要求斑马鱼应头朝左、腹部朝下、完全侧躺，所有斑马鱼的体位保持一致。斑马鱼的胆囊在斑马鱼躯干偏右侧，当斑马鱼侧躺时，如果背朝上、头向右的话，胆囊可能会对拍照造成干扰。为了保证所有斑马鱼的体位尽量固定并保持一致，建议用低熔点琼脂糖或甲基纤维素等对斑马鱼进行固定。荧光显微镜拍照时，相机的相关参数设置应既能保证拍到荧光信号、又能很大程度减少背景噪点，尽量减少背景干扰。整个荧光显微镜拍照过程中要尽量减少可见光照射或照射强度，以免荧光试剂猝灭过快，干扰实验结果。斑马鱼从开始麻醉到拍照结束的时间不宜超过30分钟，超过30分钟可能会对斑马鱼造成损伤或导致死亡。利用图像处理软件对图像进行分析，测量累积光密度（体视显微镜）或荧光强度（荧光显微镜），为了保证后续统计分析结果的有效性，每组的有效数据量不低于10个。
c）运动行为分析：正式记录前，根据实验需求可进行预跑10 min，以检测及维持仪器稳定并可使斑马鱼更好的适应环境，记录时间宜为20 min-1 h，为了保证后续统计分析结果的有效性，每组的有效数据量不低于10个。
结果评价及解读
1. 统计分析
标准原文：
1.1 利用统计分析软件进行相关图表制作与统计学分析。计算各组试验的平均值（Mean）及标准误差（Standard Error，SE），统计学处理结果用Mean ± SE表示。宜采用方差分析，按方差分析的程序先进行正态性检验（P值）和方差齐性检验（F值）。
1.2 当F<0.05，P<0.05时，各组均数间组间至少有一组有显著性差异，宜采用非参数检验。
1.3 当F≥0.05，P≥0.05时，采用单因素方差分析，选择事后两两比较的结果进行统计。
1.4 对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计。若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
2. 结果有效性分析
标准原文：
2.1 正常对照组（当使用了助溶剂，也包括溶剂对照组）斑马鱼的死亡率或异常率不得超过10%，超过10%则该次试验结果视为无效。
2.2 模型对照组与正常对照组之间的原始数据存在统计学上的显著性差异，阳性对照组与模型对照组之间的原始数据存在统计学上的显著性差异，否则该次试验结果视为无效。
2.3 当使用了助溶剂，溶剂对照组与正常对照组之间的原始数据不能存在统计学上的显著性差异，否则该次试验结果视为无效。
标准解读：
根据前期积累的大量实验数据以及本次用已上市保健食品和在研保健食品开展的验证实验结果，当且仅当一个实验满足如下的质量控制要求时，实验结果的有效性才会被认可。只准许有效试验结果进入试验报告撰写/审核阶段。
实验报告撰写及解读
标准原文：
试验报告应包括以下内容：
a) 检测依据；
b) 受试样品和阳性对照的信息，包括与试验操作相关的理化性状；
c) 斑马鱼来源和品系等相关信息；
d) 试验条件和方法，包括试验具体步骤；
e) 试验开始至完成的日期；
f) 试验结果，包括测定数据、计算值、图像数据等；
g) 数据处理与统计方法；
h) 结论。
标准解读：
试验报告应包括：检测依据、受试样品和阳性对照的信息、斑马鱼来源和品系等相关信息、试验条件和方法、试验开始至完成的日期、试验结果、数据处理与统计方法、结论。
实施意义
该标准是环特生物携手国内22家权威科研院所、企业发布的用于食品保健功能检测的完整斑马鱼技术规程，不仅填补了我国食品保健功能检测领域斑马鱼技术规程团体标准的空白，从检测依据、斑马鱼来源和品系等信息、试验条件和方法、试验结果、数据处理与统计方法、推荐参数等关键技术内容进行了充分的实验规范规定及技术创新，其结果适用于保健食品、功能性食品及其原料和配方的功能评价，可操作性、先进性等关键指标均达到了先进水平。
而且，该标准将进一步助力我国斑马鱼技术应用标准体系的完善，全面提升我国斑马鱼技术在保健食品行业功能评价方面的标准化及应用化水平等，对行业具有重要的指导性意义与推动性作用。