简介

荧光素是最流行和多功能的生物发光底物。萤火虫荧光素酶/荧光素生物发光系统存在于萤火虫（Photinus pyralis）和其他几种甲虫中。荧光素酶通过二氧杂环丁酮中间体氧化ATP活化的荧光素。萤火虫荧光素酶通过荧光素的ATP依赖性氧化产生光。来自该反应的560nm化学发光在数秒内达到峰值，当荧光素和ATP过量存在时，光输出与荧光素酶活性成比例。萤火虫荧光素酶长期以来与抗体结合，并在荧光素作为检测底物的免疫测定中用作标记物。与HRP和碱性磷酸酶相比，荧光素酶对化学修饰的耐受性较差。该酶的一个特别优点是除了其高灵敏度之外，在哺乳动物组织中存在低内源荧光素酶活性。荧光素酶的另一个重要用途是卫生监测领域。荧光素酶/荧光素系统可用于检测污染，因为存在于所有生物体中的ATP需要产生发光。这种ATP生物发光的主要应用是通过测试食品加工厂的表面来确定质量，以确定是否存在设备或产品的污染。

基本信息

储存方式：

储存在-20°C干燥。 避免光线。 到期日为自收到之日起一年。

操作步骤

注1：D-荧光素盐易溶于水缓冲液，最高可达100 mM。 储备溶液可以在不含ATP的水中制备，并储存在-20°C，避光。 必须用适当的碱中和游离酸以溶解。

注2：D-荧光素可与任何现有的报告分析或ATP分析系统一起使用。

注3：如果测试ATP，请戴上手套并使用无ATP容器，尽量减少所有可能的ATP污染源。 仅使用无菌无ATP水和试剂。 所有试剂制剂均使用高压灭菌水。

以下方案是钾盐和钠盐制备的一个例子，它可以适用于大多数细胞类型和体内动物用途。

1.用于体外生物发光图像测定的示例性方案

1.1。 在无菌水中制备100mM（100-200X）荧光素原液。 好好混合。 立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

1.2。 在预热的组织培养基中制备0.5-1mM的D-荧光素工作溶液。

1.3。 从培养细胞中吸出培养基。

1.4。 将荧光素工作溶液添加到细胞中，并在成像前将细胞在37℃下孵育5-10分钟。

2.用于体内生物发光图像测定的示例性方案

2.1。 在DPBS中制备15mg / mL荧光素储备溶液混合均匀，不含Mg2 +和Ca2 +。

2.2。 过滤器通过0.2μm过滤器对溶液进行消毒。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

2.3。在动物体重150mg / kg（或10μL/ g荧光素储备溶液）成像前10-15分钟腹膜内（i.p.）注射荧光素。

注意：应对每种动物模型进行荧光素的动力学研究，以确定峰值信号时间。

3.荧光素报道分子测定的示例方案

3.1。 在无菌水中制备100mM荧光素储备溶液。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

3.2。 制备1mM D-荧光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine缓冲液，pH7.8。

3.3。 移取5-10μl细胞裂解物到微量培养板中。 使用不含裂解液的裂解试剂或缓冲液作为空白。

3.4。 根据制造商的说明，使用荧光素工作溶液的Prime光度计。

3.5。 注入200μl荧光素工作溶液，没有延迟和10秒的积分时间。

参考文献

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