黑色素瘤组织中，与细胞焦亡相关的基因（PRGs）GZMA、GSDMB、NLRP1、IL18和CHMP4A的阳性细胞比例低于正常皮肤。细胞焦亡是一种影响肿瘤微环境和肿瘤免疫治疗的新领域。然而，细胞焦亡的作用仍有争议，部分原因是由于黑色素瘤的细胞组成异质性。

2023年8月，上海中医药研究院皮肤病研究所李斌教授团队在Cell Death& Disease杂志上发表题为 Clinical-mediated discovery of pyroptosis in CD8+ T cell and NK cell reveals melanoma heterogeneity by single-cell and bulk sequence 的研究论文。

本文对黑色素瘤标本的单细胞转录组进行了全面分析。我们发现PRGs的表达在免疫细胞中，如CD8+细胞（代表CD8+ T细胞）和CD57+细胞（代表NK细胞）中失调。此外，免疫组化和多重免疫荧光染色实验结果进一步证实了GZMA+细胞和GSDMB+细胞主要在免疫细胞中表达，特别是在CD8+ T细胞和NK细胞中。

黑色素瘤标本中，GZMA+合并CD8+ T细胞（0.11%）和GSDMB+合并CD57+细胞（0.08%）的存在量很少，而对照组分别为4.02%和0.62%。这些发现表明，肿瘤中免疫细胞的减少可能降低了细胞焦亡的能力，从而对抗黑色素瘤的特性构成了潜在的风险。

我们根据单细胞和整体RNA-seq分析，构建了一个预后风险模型和个体化的预测模型（C指数=0.58，P = 0.002），提示PRGs在恶性黑色素瘤的预防中可能发挥作用。总之，通过实验验证鉴定了免疫细胞群和免疫基因模块，有助于我们更好地理解黑色素瘤中的细胞焦亡。

实验部分

本文中，研究者使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统获取图像。获取到图像利用StrataQuest软件进行定量分析。

Panel 1 ：DAPI，CD8，GZMA，GSDMB

Panel 2：DAPI，CD57，GZMA，GSDMB

虽然细胞焦亡对癌症的影响尚为有定论，但是也正因为如此，针对细胞焦亡的研究仍然有广泛的未知等待探索。考虑到细胞焦亡的研究和炎症反应过程密切相关，借助于TissueFAXS Cytometry技术，结合多色免疫荧光染色，不但可以精准识别焦亡相关特异性蛋白表达的细胞，还可以实现对细胞焦亡水平在组织中的空间分布、形态特征、与其他细胞类型的相互作用等方面的高通量、高精度、高信息量的定量分析。

在单细胞定量水平上，先通过识别细胞核标记对细胞进行计数，继而借助于Tissue Cytometry的核扩张算法精准对细胞质/膜染色的形态进行识别。在获得单细胞真实染色的轮廓区域后，对每个细胞蛋白标记的所有像素强度进行统计分析，最终获得单个细胞蛋白表达的真实强度水平。这种方法用于阳性阈值的精准筛选划分，甚至更进一步鉴定了阳性细胞与相邻的阴性细胞的作用关系。

在本文中作者还利用了多组学研究的思路，对黑色素瘤发病机制有关的细胞 - 细胞相互作用网络提出了新的见解思路，以CD8阳性T细胞作为研究线索观察到CD8细胞边缘浸润的失调，进一步为肿瘤免疫的相关机制研究拓展了研究领域的广度。除此之外，针对NK细胞、GZMA 细胞和 GSDMB 细胞也均进行了原位精准空间定量分析，为后续的深入研究奠定了扎实的基础。在这些研究中，在切片原位的多重免疫组化标记，针对不同表型细胞的蛋白表达及细胞分布分析，也都是利用TissueFAXS Cytometry技术来进行的个体化精准定量分析。

Figure 1 GZMA+细胞和GSDMB+细胞由CD8+T细胞分泌。

A：对照组和黑色素瘤组织的多色免疫荧光染色图像。DAPI(蓝色)、CD8(粉色)、GZMA(绿色)和GSDMB(红色)。

B：CD8+GZMA+共定位和CD8+GSDMB+共定位散点图。

Figure 2 NK T细胞分泌GZMA+细胞和GSDMB+细胞

A：对照组和黑色素瘤组织的多色免疫荧光染色图像。DAPI(蓝色)、CD57(粉色)、GZMA(绿色)和GSDMB(红色)。

B：CD8+GZMA+共定位，CD8+GSDMB+共定位，CD57+GZMA+和CD57+GSDMB+散点图。